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18 août

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MET

Coloration négative

La coloration négative est utilisée pour l'observation de particules nanométriques en suspension ou pour mettre en évidence des structures très fines comme les flagelles de bactéries. Les contrastants utilisés sont l’acétate d’uranyle, l’uranyless ou l’acide phosphotungstique. Le dépôt des solutions est réalisé sur des grilles membranées (collodion carbone ou formwar-carbone) dont la charge et l'hydrophobicité peuvent être modifiées à l'aide d'un glow discharge.

Flagelles d'E.coli - C. Roques - UMR 5503 LGC
Flagelles d'E.coli - C. Roques - UMR 5503 LGC




Techniques de préparation en vue d'une observation ultrastructurale


L'objectif de ces techniques est d'obtenir des coupes de 70 nm d'épaisseur d'échantillons inclus en résine. Les coupes sont contrastées avec de l'acétate d'uranyle ou de l'uranyless suivi ou non d'un contraste au citrate de plomb.

Classiquement, la préparation utilisée pour l'observation de l'ultrastructure des cellules et des tissus est caractérisée par une fixation au glutaraldéhyde, une post fixation à l'osmium et une imprégnation dans une résine époxy qui polymérise à chaud (Etuve à 60°C).

Coupe d'intestin - B. Payré -CMEAB

Coupe d'intestin - B. Payré -CMEAB



Pour les échantillons dont la structure rend difficile la pénétration de la résine (levures, bactéries, végétaux...), nous utilisons l'automate AMW qui permet une imprégnation améliorée sous micro-ondes. La polymérisation peut se faire à chaud en étuve ou dans l'automate sous micro-ondes (en 3h).

Coupe de levure en AMW - I. Fourquaux - CMEAB
Coupe de levure en AMW - I. Fourquaux - CMEAB 




Techniques de préparation pour la localisation d'antigènes


Les techniques de cryo-préparation
ont pour propriété de mieux préserver les antigènes et sont donc préférées pour la localisation d'antigènes par immunogold (anticorps secondaires liés à une bille d'or). Les immunomarquages sont ensuite réalisés manuellement ou à l'aide d'un automate (IGL).

Nous réalisons au centre deux types de cryo-techniques :

La PLT (progressive lowering of temperature)
est une technique permettant une imprégnation, une substitution et une polymérisation à très basse température dans un AFS (automate de substitution à froid). Cette technique utilise des résines acryliques qui polymérisent sous Ultra Violet à très basse température et dont l'hydrophobicité facilite la liaison antigène-anticorps.

Coupe de cardiomyocytes en AFS - C. Guilbeau-Frugier - I2MC équipe 8
Coupe de cardiomyocytes en AFS - C. Guilbeau-Frugier - I2MC équipe 8


La technique de Tokuyasu est une technique qui n'utilise pas de résine. L'échantillon, après une fixation chimique (généralement  au paraformaldéhyde) et une imprégnation dans un cryoprotectant, est directement congelé dans de l'azote liquide. Le bloc obtenu est coupé à l'aide d'un cryo-ultramicrotome et la coupe de 70 nm d'épaisseur est ramenée à température ambiante afin de réaliser un immunomarquage.

Marquage Claudine 5 sur disques intercalaires de cardiomyocytes - C. Guilbeau-Frugier - I2MC équipe 8






Date de mise à jour 10 mars 2017


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